脉冲场凝胶电泳

 

当双链DNA分子超过一定的大小以后，DNA双螺旋的半径超过了凝胶的孔径，在琼脂糖中的电泳速度会达到极限，此时凝胶不能按照分子大小来筛分DNA,脉冲场电泳就解决了这一难题

脉冲电泳是在两个不同方向的电场，周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子

脉冲场凝胶电泳

1 仪器： WD-2101A脉冲电泳系统

2 配套试剂：脉冲电泳专用琼脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE

3 染料：GelRed等

在凝胶电泳中，温度越高，DNA移动的速度越快，但是条带的清晰度和分辨率会明显下降。温度过高会导致DNA带变形或解链，一般设置电泳温度为14℃

常用缓冲液是0.5×TBE

H9812，2.2s-63.8s，19h

脉冲场电泳常见问题及解决办法

1）凝胶在缓冲液中漂浮–蠕动泵的速度太快或太慢， 调到合适的速度

2）缓冲液不流动或流速慢–检查冷却泵：当冷却泵制 冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导 致管道堵塞

3）电泳条带扭曲–流速太低，导致制冷不充分，或不 均一、缓冲液的体积不能太小

4）条带变粗–减少上样量

5）条带拖尾或模糊–电场转换时间不合适，优化转换 电场转换时间、上样量太高，调整样品浓度

6）大片段DNA不能有效分离–将低电压、延长电场转换 时间

7）条带弯曲–缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、上 样时样品块被挤碎、泵速度太慢

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在引发剂（eg.APS）和加速剂（eg.TEMED）的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）。
 
聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：

1 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。

2 化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。

3 对pH和温度变化较稳定。

4 几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样 品分离重复性好。

5 样品不易扩散，且用量少。

6 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。

7 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和 电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电 泳等有更高的分辨率。

聚丙烯酰胺凝胶聚合

聚合原理

1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成的。 催化系统常用有两种： 过硫酸氨—TEMED化学催化聚合系统 此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。

2. 核黄素—TEMED光聚合催化系统 此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。

凝胶孔径的可调性及性质

1）聚丙烯酰胺凝胶的孔径的大小是由单体和双体在凝胶中的总浓度（T），以及双体占总浓度的百分含量（C）即交联度决定的。通常凝胶的筛孔、透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加

2）凝胶浓度与孔径的关系： T与C不仅与凝胶的机械性能有关，还与凝胶的孔径关 系极为密切。一般讲，T浓度大，孔径小，移动颗粒 穿过网孔阻力大。此外，孔径还同Acr与Bis的比例有 关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。

3）凝胶浓度与被分离物相对分子量质的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的相对分子质量也不同。在操作时，可根据被分离物相对分子质量大小选择所需凝胶的浓度范围。也可先选用7.5%凝胶(标准胶)，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得较满意的结果。如分析未知样品时也可用4%-10%的梯度胶测试，根据分离情况选择适宜的浓度以取得理想的分离效果。