罗氏KAPA2G DNA聚合酶—PCR界的多、快、好、省

转自罗氏诊断生命科学公众号

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，其核心就是DNA聚合酶。目前分子生物学领域中很多都是使用野生型的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶等天然形式存在的酶。野生型的Taq聚合酶由于本身的结构导致功能有限，经常会遇到如扩增效率低，特异性差，启动速度慢，模板GC含量异常等扩增不出的问题。随着新兴技术的发展，对DNA扩增酶的需求越来越高，能否进行快速扩增、能否有效扩增复杂样本、能否进行多重扩增成为DNA扩增酶亟待解决的问题。

2018年，来自加州理工学院的Frances H. Arnold教授因为“酶的定向进化”这一领域的贡献，获得诺贝尔化学奖。定向进化允许对酶功能进行持续改进，例如提高热稳定性、比活性、持续合成能力或对抑制剂的抗性。Roche旗下Kapa Biosystems成功利用其定向进化技术（Directed evolution technology platform）设计出KAPA2G快速热启动DNA聚合酶。KAPA2G快速热启动DNA聚合酶是抗体介导的热启动聚合酶，具有更高的扩增性能和速度。其具有1 s/kb的延伸速度，相比于野生型Taq DNA聚合酶1min/kb的扩增速度，能够极大地缩短总循环时间。在具有强大的扩增速度下，KAPA2G快速热启动DNA聚合酶同时具有相当强大的“耐受”能力，面对粗制样本、GC异常样本均具有优秀的扩增能力。另外在多重扩增方面也表现优秀。针对当前PCR面临的“快速、稳健和多重”的痛点，KAPA2G系列分别能够提供KAPA2G Fast、KAPA2G Robust和KAPA2G Multiplex三种类型的产品，真正是PCR里的多、快、好、省。

KAPA2G系列产品适合的应用：

多重PCR扩增

法医学检测

多重扩增毛细管电泳检测

宏基因组测序mNGS

病原靶向测序tNGS

遗传病多重扩增检测

“多”重

—KAPA2G Fast HS Multiplex

KAPA2G Fast HS Multiplex试剂盒包含KAPA2G快速热启动DNA 聚合酶。除了具有快速扩增速度外，KAPA2G Fast HS Multiplex还能提供更高的产量和灵敏度，与高度多重的PCR。

高通量测序现在已经广泛用于病原微生物和肿瘤检测，但是不同起始样本质量参差不齐，部分样本中某些基因丰度太低，直接进行建库测序可能导致结果不准确甚至出现漏检。斯坦福大学的Zhang¹等人利用KAPA2G Fast HS Multiplex进行测序前的预扩增，能够将样本中靶基因丰度提升1000倍左右，有效的提高整体检测准确性和完整度。另外NGS测序的结果验证同样重要，目前常用的方法是进行RT-PCR验证，常见的RT-PCR一次只能检测一到二个基因。Miljani´c²等利用KAPA2G Fast HS Multiplex建立多重RT-PCR技术—mRT-PCR（Multiplex），能够对测序结果进行快速高效验证。病原靶向测序技术是一种新型技术，将超多重PCR扩增与高通量测序两种技术结合，可以对待测样本中几十种至几百种的目标基因进行检测。这种方法的提前就是需要DNA扩增酶具有强大的多重扩增能力。Franken³等利用KAPA2G Fast HS Multiplex的超多重扩增能力，建立了一种基于靶向基因多重扩增高通量测序的方法，用于提高乳腺癌的靶向治疗。

图A：使用KAPA2G Fast Multiplex进行快速多重PCR可以节省 40 – 60% 的时间。

图B：使用KAPA2G Fast Multiplex进行GC丰富的多重PCR（6 重）实验，能够有效扩增全部目标片段。

数据来源：罗氏诊断实验室整理

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KAPA2G Fast Multiplex特点：

节省时间

预混液无需过多优化，对多重PCR体系缩短循环时间高达60%

强劲多重性能

KAPA2G Fast Multiplex对应对富含GC或AT序列的靶标均具有优秀性能，同时对体系中超多重靶标扩增具有优秀均一性

“快”速

—KAPA2G Fast

KAPA2G Fast试剂盒是一款旨在解决快速PCR的产品。相比于野生型Taq聚合酶，其有用更高的合成能力和速度。除了超快的扩增速度，KAPA2G Fast还提供能够具有更高的扩增效率和扩增能力。

图A：KAPA2G Fast HotStart聚合酶有效扩增5个不同大小的人基因片段，其中延伸时间为1秒/循环。

图B：使用野生型Taq DNA聚合酶和KAPA2G Fast DNA聚合酶扩增人基因组DNA (≤3.5 kb) 和lambda (≤5 kb)不同长度片段的总反应时间，反应时间基于试剂盒推荐的35循环程序。

数据来源：罗氏诊断实验室整理

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KAPA2G Fast特点：

节省宝贵时间

延伸时间可达到1秒/kb，减少PCR反应时间达75%

应对复杂模板

覆盖高AT和高GC含量的靶标

持续提升PCR反应的开发

热启动和即用型制式

“好”扩

—KAPA2G Robust

KAPA2G Robust试剂盒通过更高的合成速率和特异性赋予PCR更加强健的表现、更高的灵敏度和更好的常规反应抑制剂耐受能力。KAPA2G Robust试剂盒适用于复杂困难样本类型等具有挑战性的PCR应用，无需在酶类选择和反应方案层面的过多优化。

进行PCR反应过程中是常常会遇到模板异常的情况，比如粗制提取，含有各种PCR抑制物，或者GC丰度异常的样本，这类型样本在进行高通量测序时难以直接进行建库，非常考验建库DNA酶扩增能力。TERT（telomerase reverse transcriptase）启动子突变的检测是诊断胶质母细胞瘤的关键因子，然而TERT启动子的GC含量在80%以上，一般的DNA聚合酶难以进行扩增。Ward⁴等利用KAPA2G Robust对模板高GC的耐受能力，成功扩增TERT启动子并开展下游的测序工作。

图A：使用KAPA2G Robust和野生型Taq 聚合酶，在四种常见PCR抑制剂存在的条件成功扩增出从1pg质粒DNA扩增1.5kb片段。

图B：使用KAPA2G Robust对72种不同GC含量的PCR产物进行扩增。

数据来源：罗氏实验室整理

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KAPA2G Robust特点：

轻松应对粗提样本

KAPA2G Robust对抑制剂残留和粗提样本PCR有很高的耐受能力（例如FFPE样本）

在具有挑战性的应用中实现高灵敏度

每单位酶呈现高得率

提升复杂困难样本的 PCR 表现

应对富含GC和AT序列的靶标并且减少您的反应优化时间

“省”心

—罗氏诊断的品质保证

罗氏生命科学部的工业原料产品作为罗氏产品大家族中的一员，秉承了罗氏公司一贯坚持的高品质特性，为各生产企业、大型研究所、研发中心等提供上佳的原料来源，包括分子诊断、临床生化、免疫检测和生物制药等各应用领域。除了高品质的产品外，提供高水准的产品服务和技术服务也是罗氏诊断致力追求的目标。我们期待着和您携手共进，赢向未来。

产品	规格	货号
KAPA2G Fast HS	12500U	7983239001
KAPA2G Robust Hotstart Ready Mix预混液	12.5mL	08041113001
KAPA2G Fast HS Multiplex预混液	50mL	09077898001

参考文献：

Zhang R, Li X, Ramaswami G, et al. Quantifying RNA allelic ratios by microfluidic multiplex PCR and sequencing. Nature methods, 2014, 11(1): 51-54.
Miljanić V, Jakše J, Rusjan D, et al. Small RNA Sequencing and Multiplex RT-PCR for Diagnostics of Grapevine Viruses and Virus-like Organisms. Viruses, 2022, 14(5): 921.
Franken A, Rivandi M, Yang L, et al. A multiplex PCR-based next generation sequencing-panel to identify mutations for targeted therapy in breast cancer circulating tumor cells. Applied Sciences, 2020, 10(10): 3364.
Ward D G, Baxter L, Gordon N S, et al. Multiplex PCR and next generation sequencing for the non-invasive detection of bladder cancer. PloS one, 2016, 11(2): e0149756.

*不用于临床诊断。MC-CN-02503 有效期至2025年11月8日。

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