小罗开讲 | 数字PCR之微反应体系气泡控制

转自：罗氏诊断生命科学公众号

大家好，本堂课小罗将带领大家继续学习数字PCR，了解微反应体系气泡控制对数字PCR的影响。

dPCR技术概述

数字聚合酶链式反应 (dPCR)，被视为第三代PCR 技术，是一种高精度的核酸检测方法，无需校准即可实现目标模板的绝对定量。在 dPCR 中，含有目标核酸的样品被分为数以万计的分区，每个分区包含一个、几个或没有目标模板。扩增后，根据荧光强度将分区分为“阳性”或“阴性”，最后根据泊松算法计算模板的原始浓度。

与传统的实时定量PCR（qPCR）相比，dPCR具有许多优点，包括高精度和灵敏度、无需校准曲线即可对目标核酸进行绝对定量，以及检测低浓度目标核酸的能力。dPCR凭借其出色的性能，已广泛应用于核酸检测，包括低丰度病原基因检测、基因拷贝数变异 (CNV) 分析、单细胞基因表达分析、遗传等位基因失衡检测和无创产前检测 (NIPT)等领域^[1]。

现象—加热导致气泡产生及影响

dPCR 技术实现上述优异性能表现的关键步骤是生成大量统一且独立的分区，通常通过两种策略来实现：

一种是基于微孔，将样品分配到数千到数万个微孔腔室中；
另一种是基于液滴的，将样品分成皮升到纳升的液滴，分散在不混溶的油中。

无论哪种分区方式，完成分区后，都要利用温度控制模块对所有微反应单元进行温度循环以完成扩增反应，从而将目标片段进行信号放大。然而，在温度循环中最显著的问题是溶解在PCR反应体系或油相中气体的逸散，根据气体的溶解性质，气体在液体中的溶解度会随着温度升高会大幅度降低^[2]，而这一特性对数字PCR来说，尤为重要。

图1.（图片来源：罗氏诊断整理）

PCR反应过程中伴随着剧烈的温度升降，由于温度升高时气体溶解度降低，会因脱气（degassing）而形成微小气泡。脱气是芯片上聚合酶链式反应 (PCR) 失败的一个众所周知的原因，气泡的形成会对数字PCR反应会产生诸多方面的影响，如导致加热不均匀，挤压 PCR混合物从反应室排出，出现的气泡可能会取代反应室中的乳液，以及对液滴施加剪切力，从而导致液滴合并等问题，这些事件的发生均会对微孔阴阳性判断造成干扰，进而对定量的准确性产生影响^[3]。

图2.（图片来源：罗氏诊断整理）

如何防止气泡形成？

此前已经有很多研究者描述了许多不同的方法来避免气泡产生的问题。可以分为被动和主动方法两大类，使用的主要技术包括气泡陷阱（bubble traps）、气泡消除以及预防气泡形成等方法，见表1。

Bubble traps通过将气泡限制在特定区域以减少其干扰，已经被应用到多种微流控体系中，但该方法受温度的影响极为明显，高温会导致气泡剧烈膨胀，进而导致扩散，因此在温度变化剧烈的数字PCR反应中，该策略有明显的局限性。

表1.（来源：罗氏诊断整理）

气体在液体的溶解度除了受到温度的显著影响以外，气压变化也会明显改变气体溶解度。一般来说，随着气压的增加，气体在液体中的溶解度会随之升高^[2]。因而，对数字PCR体系进行系统加压以增加气体在液体中的溶解度，是预防气泡形成的有效手段。

已有研究表明，具有主动外部压力产生的加压系统可以完全避免dPCR反应过程中气泡产生的现象，能够有效降低数字PCR在扩增循环中由于温度急剧变化带来的气泡形成和扩散，进而避免了由此导致的微反应单元独立性受损的情况，为精准定量提供保障^[5]。

图3.（图片来源：罗氏诊断整理）

此外，芯片法数字PCR技术在微孔生成的时候，由于反应体系表面张力与芯片表面处理等原因，仍然有一定几率出现“空泡”现象，即某些微孔无法被反应体系填充，而是被气体占位，PCR加热过程会导致气泡膨胀，会对周围的反应孔产生挤压并导致反应体系的逸散，原本封闭的独立反应单元无法独立进行片段扩增，将会对定量结果产生显著的影响。因此，对反应体系进行系统加压，也是有效限制高温导致的气泡膨胀行之有效的办法。

值得一提的是，这类“空泡”微孔在信号采集时容易被误认为阴性微孔，而实际上这类微孔不应该被纳入阴阳性计算。因此，数字PCR的反应体系具备质控成为一个非常重要的条件，该条件可通过在体系中添加特定的荧光染料予以实现。扩增完成后，应在进行微孔阴阳性判断前通过质控染料将假阴性孔排除，再分别对阴阳性微孔进行计数，最后才能通过泊松分布校正得到更为准确的定量结果。